(dott.ssa Giulia Bini)
Tratto da: Obradovic et al., 2020. Immune response and protection against Lawsonia intracellularis infections in pigs.
Lawsonia intracellularis è un batterio Gram negativo, intracellulare obbligato che causa due distinte forme di malattia, entrambe economicamente impattanti dal punto di vista economico per gli allevamenti suini. Le due distinte forme cliniche sono l’adenomatosi intestinale e l’enteropatia emorragica proliferativa; queste differiscono per gravità, segni clinici ed età degli animali colpiti. Lawsonia intracellularis ha distribuzione globale ed è stata identificata nei suini domestici e selvatici con una maggiore prevalenza negli allevamenti intensivi.
L’adenomatosi intestinale è la forma più comune di enteropatia proliferativa; è un’infezione cronica che viene diagnosticata solitamente fra le 6-20 settimane di vita del suino. I segni clinici sono caratterizzati da una scarsa crescita, mancanza di appetito e diarrea acquosa. Alcuni animali, specialmente nella fase di ingrasso, possono avere forme subcliniche che vengono identificate solamente al macello. Le lesioni tipiche di questa forma proliferativa sono caratterizzate da un ispessimento della mucosa intestinale di ileo e digiuno, dovuto alla proliferazione di enterociti immaturi che possono essere osservati microscopicamente e alla relativa assenza di cellule infiammatorie attorno alle cripte.
La forma proliferativa emorragica è quella acuta e più grave e colpisce animali dai 4 ai 12 mesi di vita. I segni tipici includono sanguinamento intestinale e tassi di mortalità elevati. Dal punto di vista anatomopatologico l’intestino appare disteso ed inspessito ed il lume ripieno di sangue e/o coaguli di fibrina. Microscopicamente vi è la proliferazione di cellule immature con forte lisi e segni di infiammazione che invece sono meno presenti negli animali colpiti dalla forma cronica.
È interessante notare come suini gnotobiotici (ovvero che possiedono solamente alcuni ceppi batterici ben noti) si siano mostrati resistenti all’infezione ma siano diventati sensibili quando la loro flora commensale intestinale è stata ripristinata. Queste scoperte suggeriscono come i batteri commensali, i loro metaboliti o la loro influenza sullo sviluppo intestinale impattino sull’abilità di Lawsonia intracellularis di infettare l’ospite. Gli esatti meccanismi o il tipo di batteri commensali coinvolti devono ancora essere chiariti.
L’infezione da Lawsonia intracellularis induce una distinta risposta immunitaria con modelli cellulari e molecolari unici nell’intestino che però non sono ancora del tutto conosciuti.
Lawsonia intracellularis è responsabile di entrambe le forme di malattia ma non sono state riscontrate differenze patogenetiche nei diversi ceppi isolati. Pertanto, è ragionevole pensare che le differenti forme cliniche dipendano da fattori legati all’ospite come: genetica, età degli animali, maturità del sistema immunitario al momento dell’infezione, presenza di anticorpi materni specifici, presenza di batteri commensali specifici, alimentazione, ecc…
Questo articolo vuole approfondire i diversi meccanismi immunitari che si instaurano step by step in corso di infezione da Lawsonia intracellularis.
Generalmente, l’infezione da Lawsonia intracellularis che porta allo sviluppo della forma adenomatosa promuove una moderata risposta immunitaria con una limitata infiltrazione di cellule B, linfociti CD8+ e CD25+ nella lamina propria di digiuno, ileo e colon. Nei suini con la forma emorragica la risposta immunitaria è maggiore ma comunque l’infiltrazione di macrofagi, neutrofili e linfociti CD8+ e CD25+ nella lamina propria è modesta.
Risposta immunitaria verso Lawsonia intracellularis durante la patogenesi precoce (forma adenomatosa; 1-14 giorni PI)
Come detto in precedenza non è ancora noto cosa scateni la forma proliferativa piuttosto che la forma emorragica. Uno studio del 2010 ha indagato la patogenesi. Suini di 5 settimane infettati sperimentalmente hanno mostrato come Lawsonia intracellularis infetti le cellule epiteliali del piccolo intestino già 12 ore post infezione. A 36 ore post infezione sono già presenti foci batterici di discrete dimensioni e a 5 giorni dall’infezione si trova nella lamina propria che circonda le cripte, anch’esse fortemente infette.
Un altro studio ha rivelato che al progredire dell’infezione Lawsonia intracellularis moltiplica all’interno delle cellule epiteliali che rivestono le cripte i batteri possono essere rinvenuti negli enterociti e all’apice dei villi senza che ancora siano evidenti questi segni tipici di iper-proliferazione.
In generale, nelle fasi precoci dell’infezione, Lawsonia intracellularis moltiplica nel lume del piccolo intestino, sopravvive alla competizione coi batteri commensali e attraversa la barriera mucosale per infettare le cellule ospiti. Inoltre, è in grado di evitare l’effetto immediato dell’immunità innata che normalmente si scatena nelle fasi iniziali delle infezioni sostenute da altri patogeni intestinali. Sembra che la risposta immunitaria innata ed adattativa subiscano un ritardo o si scatenino in maniera lieve, lasciando campo libero a Lawsonia intracellularis. Questo ritardo nella risposta sembra risiedere nella singolare maniera con cui Lawsonia intracellularis infetta le cellule epiteliali immature delle cripte intestinali portando ad uno stato di transitoria immunodepressione nei primi giorni post infezione. Questa risposta ritardata o soppressa aiuta il batterio a sopravvivere, moltiplicarsi e diffondersi dentro le cripte intestinali dando quindi il via ai segni caratteristici della forma adenomatosa.
L’infezione da Lawsonia intracellularis influenza anche i profili delle citochine sieriche nel corso della patogenesi. In suini di 5 settimane infettati per via sperimentale si è verificato un innalzamento dei titoli sierici del TNF-a, IFN-y e IL-6 e un picco degli stessi nei giorni successivi.
Le citochine sembrano svolgere un ruolo importante in corso di infezione ma ne va ancora compreso a pieno il ruolo. Deve comunque esserci un equilibrio fra le citochine pro-infiammatorie e quelle ad azione soppressiva.
L’infezione va anche a modificare l’espressione di geni coinvolti nell’immunità cellulo-mediata. In uno studio è stato evidenziato che a livello di enterociti vi era una sotto-regolazione del gene che codifica per una molecola che funge da segnale di attivazione per le cellule T.
Risposta immunitaria verso Lawsonia intracellularis durante la patogenesi media (forma adenomatosa; 14-42 giorni PI)
L’infezione da Lawsonia intracellularis che porta alla forma adenomatosa presenta le caratteristiche alterazioni microscopiche e macroscopiche di infiltrazione di cellule immunitarie da 14 a 24 giorni post infezione, momento che corrisponde al picco della carica batterica.
Entro 15 giorni post infezione i batteri si diffondono attraverso l’intestino tenue e crasso causando diffusa iperplasia delle cellule epiteliali immature nell’ileo, ceco, colon prossimale e spirale e digiuno. Durante questo periodo gli antigeni batterici vengono rilevati nelle cripte e nella lamina propria di ileo e digiuno, nel lume e nel citoplasma delle cripte del duodeno, colon prossimale e spirale, ceco e retto e anche nei linfonodi della sottomucosa del colon prossimale.
Durante questo periodo i batteri vengono assorbiti dalle cellule presentanti l’antigene nella lamina propria e sono presentati ai linfociti nei tessuti linfoidi che iniziano una risposta immunitaria adattativa antigene-specifica. Altri studi hanno mostrato la forte presenza di macrofagi nelle zone adiacenti le cripte infette dal 14esimo giorno post infezione.
Il coinvolgimento e l’attivazione dei macrofagi può spiegare l’improvviso aumento delle citochine pro-infiammatorie a questo punto temporale della patogenesi. Il TNF-a è la prima citochina ad innalzarsi a 5-10 giorni post infezione, seguita da IFNy e IL-6. Queste citochine pro-infiammatorie giocano un ruolo importante nell’attivazione delle cellule dell’immunità adattativa a livello intestinale ma, nel caso della forma emorragica, sono le stesse che forniscono un ambiente che contribuisce all’infiammazione incontrollata della mucosa intestinale che sfocia nella forma acuta della malattia.
Da 19-24 giorni post infezione si rendono evidenti le lesioni istopatologiche specialmente a livello di digiuno. Si innalzano anche i titoli delle IgA ad indicare un’attivazione dell’immunità adattativa a livello mucosale. Questa attività è evidente anche nei linfonodi ileo-cecali che presentano centri germinali prominenti e una porzione midollare ripiena di plasmacellule. A 29 giorni post infezione la maggior parte dei batteri è stata eliminata dalle cellule epiteliali intestinali e gli antigeni si rinvengono principalmente nel citoplasma delle cellule mononucleate della lamina propria.
Al contrario delle citochine pro-infiammatorie, quelle antinfiammatorie come TGFB e IL-4 sono rimaste a livelli bassi fino a circa 25 giorni post infezione. L’IFNy, invece, è rimasto elevato fino al 40esimo giorno circa.
L’IFNy è una citochina importante perché svolge un ruolo di protezione nei confronti dei patogeni intracellulari e potrebbe essere un fattore cruciale che media la protezione nei confronti di Lawsonia intracellularis. In topi col gene per il recettore dell’IFNy silenziato l’infezione si è risolta molto più tardivamente rispetto a topi non modificati, a dimostrazione del fatto che questa citochina svolge un ruolo importante nel contrastare l’infezione.
La concentrazione sierica di TGFB ha avuto un trend decrescente fino al 20esimo giorno post infezione e successivamente è risalita. Allo stesso modo, la concentrazione sierica di IL-10 e della chemochina IL-8 (fattore chemiotattico per i neutrofili) è aumentata a partire dal giorno 25 post infezione. Queste molecole giocano un ruolo importante nella regolazione dell’omeostasi del sistema immunitario andando a contrastare l’effetto delle citochine pro-infiammatorie e mantenendo l’effetto barriera dell’epitelio intestinale. La chemochina IL-8 stimola inoltre la fagocitosi e promuove l’angiogenesi per favorire la riparazione della mucosa danneggiata.
Da 35 a 42 giorni post infezione non sono rilevati né lesioni istologiche né antigeni batterici nelle sezioni intestinali interessate. Questo indica la clearance batterica e il ripristino dell’omeostasi intestinale.
Seguendo il decorso dell’infezione da Lawsonia intracellularis, manifestatasi nella forma adenomatosa, si osserva come i titoli di IgA e la produzione di citochine subiscano un ritardo durante i primi 5 giorni post infezione; questo permette ai batteri di diffondersi nella lamina propria. Infatti, all’inizio del periodo di infezione, Lawsonia intracellularis sembra evitare di indurre una risposta infiammatoria. Ancora non è chiaro come questa evasione del sistema immunitario avvenga (ad esempio tramite il rilascio di molecole da parte del batterio che hanno come target il sistema immunitario dell’ospite). Alla fine, la risposta immunitaria adattativa viene innescata e le risposte umorali e cellulari vengono indotte. In particolare: cellule che secernono IFNy ed elevati livelli di IgA. Nella seconda metà dell’infezione si alzano i livelli di TGFB e IL-10, ovvero citochine che svolgono una importante funzione regolatoria andando a sopprimere una infiammazione eccessiva, sottoregolano le cellule e le citochine pro-infiammatorie e aiutano il ripristino della mucosa intestinale danneggiata. Pertanto, la risoluzione dell’infezione da Lawsonia intracellularis richiede una adeguata e tempestiva attivazione delle citochine pro-infiammatorie e regolatorie al fine di risolvere con successo l’infezione e fornire una adeguata protezione immunitaria.
Protezione immunitaria dall’infezione da Lawsonia intracellularis
Una adeguata protezione immunitaria nei confronti di Lawsonia intracellularis si ottiene a seguito di una infezione primaria che perciò protegge da una re-infezione oppure a seguito della vaccinazione.
Protezione immunitaria dopo l’infezione
I suini re-infettati con Lawsonia intracellularis a seguito di una infezione primaria hanno manifestato una forma di enterite proliferativa a carattere autolimitante.
È stato dimostrato per via sperimentale che animali re-infettati con Lawsonia intracellularis non eliminavano il batterio con le feci, avevano livelli più bassi di proteine di fase acuta e concentrazioni minori di antigene batterico nella mucosa intestinale rispetto a suini infettati una sola volta. I suini infettati una sola volta eliminavano Lawsonia intracellularis con le feci e avevano livelli più alti di antigene batterico in tutte le regioni della mucosa intestinale, a riprova della massiva infezione. Inoltre, avevano elevati livelli di proteine di fase acuta nel siero. In questi animali infettati una sola volta le concentrazioni sieriche di proteina C reattiva e aptoglobina erano aumentate dal 6° giorno post infezione; le concentrazioni di aptoglobina sono rimaste elevate per 2-3 settimane post infezione. Invece, i suini re-infettati hanno mostrato concentrazioni più basse di proteina C reattiva e aptoglobina, il che riflette la mancanza di segni clinici. Le proteine di fase acuta sono indicatori non specifici di malattia e infiammazione e i loro bassi livelli negli animali infettati due volte evidenziano che la risposta innata e adattativa proteggono gli animali senza scatenare una massiva risposta infiammatoria.
In generale gli studi indicano che a seguito della seconda esposizione a Lawsonia intracellularis gli animali non mostrano i segni clinici tipici dell’enterite proliferativa, i batteri non vengono eliminati con le feci e c’è una riduzione significativa delle lesioni patologiche a livello di mucosa intestinale.
Protezione immunitaria dovuta alla vaccinazione contro Lawsonia intracellularis
Negli allevamenti intensivi moderni trovare il momento giusto per la vaccinazione è un fattore critico per proteggere la mandria contro l’enterite proliferativa. Tuttavia, l’approccio vaccinale è di fondamentale importanza soprattutto nelle situazioni endemiche o a rischio infezione, in quanto la presenza di L.intracellularis è responsabile di perdite economiche legate a ridotta resa alimentare ed accrescimento, oltre che ad un aumento del consumo di antibiotici per il controllo della sintomatologia clinica. Studi clinici hanno confermato che la vaccinazione contro L.intracellularis induce una significativa riduzione delle lesioni intestinali, assenza di segni clinici e un maggior accrescimento medio giornaliero rispetto ai soggetti non vaccinati, oltre a ridurre più che sensibilmente l’escrezione batterica interrompendo il rischio di infezione per altri soggetti non vaccinati che dovessero entrare in contatto con la mandria vaccinata.
Prospettive future della ricerca sulla risposta immunitaria e sulla vaccinazione contro Lawsonia intracellularis
Vi sono ancora molte questioni irrisolte circa la risposta immunitaria sviluppata dall’ospite nei confronti di Lawsonia intracellularis. È chiaro che le citochine siano coinvolte ma non si conosce ancora come con esattezza.
L’IFNy è una citochina importante nell’immunità mediata dalle cellule T e può essere secreta da diverse cellule della mucosa intestinale come CD4 e CD8. Può essere secreta da un mix di cellule Th1-Th17 ma come queste cellule impattino sulla patogenesi di Lawsonia intracellularis deve ancora essere studiato.
Le IgA giocano un ruolo importante nella protezione contro patogeni enterici, nella regolazione dei batteri commensali e nel mantenimento dell’omeostasi immunitaria intestinale. Sebbene titoli aumentati di IgA siano stati osservati nella mucosa intestinale di suini infetti da Lawsonia intracellularis dal giorno 15 al giorno 29 post infezione, il grado di protezione mediato di IgA è ancora sconosciuto e deve essere chiarito ulteriormente.
Nonostante siano presenti sul mercato vaccini dalla piena efficacia basati sul batterio vivo attenuato o vaccini spenti, si affacciano nel mondo della ricerca ulteriori idee per lo sviluppo di nuove alternative vaccinali. Sono stati per esempio condotti alcuni studi preliminari su un possibile vaccino ricombinante a subunità, magari con proteine chimeriche ricombinanti, in grado di stimolare sia l’immunità umorale che cellulo-mediata. Un altro passo nella vaccinazione contro L.intracellularis potrebbe essere quello di sviluppare vaccini con la strategia DIVA, ovvero che permettano la differenziazione fra animali immunizzati perché vaccinati o perché precedentemente infetti col patogeno di campo. Vaccini con questa strategia sono già disponibili per altre patologie del suino come la Malattia di Aujeszky. Questi sono vaccini vivi modificati, formulati con la mancanza di uno o più antigeni che invece sono presenti nel patogeno di campo. La natura di patogeno intracellulare obbligato di L.intracellularis limita l’uso di tecnologie per modificare l’organismo in modo da non fargli esprimere determinate proteine. La soluzione sarebbe un vaccino a subunità con strategia DIVA basato su una selezione di proteine immunogene. Si potrebbero ricercare gli anticorpi verso una proteina immunogena presente sul batterio di campo ma non inserita nel vaccino a subunità. Solo gli animali infetti avrebbero questi anticorpi, quelli vaccinati avrebbero invece gli anticorpi solo verso gli antigeni presenti nel vaccino. Questa strategia aiuterebbe i veterinari a monitorare la salute della mandria in modo più accurato e anche ad utilizzare in maniera più ponderata gli antibiotici.